碱性磷酸酶 钙钴法(改良的Gomori法,1952) 试剂配制: (1)碱性磷酸酶孵育液:2%β-甘油磷酸钠(sodiumβ-glycerophos-phate)2.5ml ,2%巴比妥钠2.5ml ,2%氯化钙4.5ml,2%硫酸镁0.2ml蒸馏水0.3ml依次混合后,pH值应为9.2-9.4。 (2)2%硝酸钴水溶液:硝酸钴(codalt nitrate)2g,蒸馏水加至100ml (3)1%硫化铵水溶液:硫化铵1ml,蒸馏水99ml 操作方法: A、冰冻切片法: 1、新鲜组织低温恒冷切片厚4-6μm,贴于玻片,风扇吹干后有冷丙酮固定10分钟。或组织用105甲醛钙于4℃冰箱固定12-18小时,冰冻切片,蒸馏水洗后贴于玻片上,风扇吹干。 2、入碱性磷酸酶孵育液(预热37℃)于37℃怛温箱孵育。 3、蒸馏水洗2-3次,每次1分钟。 4、2%硝酸钴水溶液作用5分钟。 5、蒸馏水洗2-3次,每次1分钟。 6、15硫化铵水溶液处理1分钟。 7、流水冲洗数分钟,再用蒸馏水洗。 8、阿拉伯糖胶封盖或常规脱水透明,中性树胶封固。 B、石蜡切片法: 1、新鲜组织取材2mm厚,用冷丙酮于4℃冰箱固定12-18小时。更换冷丙酮2次,每次约30-60分钟。 2、二甲苯透明2次(室温)。每次约30分钟。 3、浸蜡2-3次,每次约20-30分钟。(温度不要高于60℃)。 4、石蜡包埋。如不立即切片,蜡块放于4℃冰箱保存。 5、石蜡切片厚4-6μm,在37℃温水贴片。 6、在45℃温箱烧片1-2小时。 7、切片常规脱蜡至水。 8、入孵育液(预热至37℃)于37℃恒温箱孵育半至3小时或更长时间。 9、蒸馏水洗2-3次,每次1分钟。 10、2%硝酸钴水溶液作用5分钟。 11、蒸馏水洗2-3次,每次1分钟。 12、1%硫化铵水溶液处理1分钟。 13、流水冲洗数分钟,再用蒸馏水洗。 14、常规脱水透明,中性树胶封固。 结果:碱性磷酸酶活性处呈棕黑色沉淀。 对照方法: 1、另配一孵育液,其中省去β-甘油磷酸钠,改用等量的蒸馏水代替。 2、把切片先置入80-90℃的热水中处理10分钟,然后按上述孵育方法进行操作。 3、切片用Lugol氏碘液处理3分钟,5%硫代硫酸钠液处理1分钟,充分水洗后入孵育液。 经上述方法之一处理过的对照片应为阴性。
酸性磷酸酶 硝酸铅法(根据Gomori法) 试剂配制: (1)酸性磷酸酶孵育液:巴比妥醋酸缓冲液(pH5.0)10ml,硝酸铅(lead nitrare)12mg,3%β-甘油磷酸钠(sodiumβ-glycerop-hosp hate)1ml,先把硝酸铅溶于巴比妥醋酸缓冲液(pH5.0),然后加入β-甘油磷酸钠,混合后过滤,调pH值至pH5.0 操作方法: 1、新鲜组织低温恒冷片厚6μm,冷丙酮固定10分钟。 2、把切片置入酸性磷酸酶孵育液(预热至37℃),37℃孵育0.5- 2小时。 3、蒸馏水洗3次,每次1分钟。 4、1%冰醋酸液略洗。 5、蒸馏水浸洗2次。 6、1%硫化铵液处理1分钟。 7、流水冲洗数分钟,再用蒸馏水洗。 8、常规脱水透明,中性树胶封固。 结果:酸性磷酸酶活性处呈棕黄至棕褐色。
三磷酸腺苷酶 钙激活法(1973) 试剂配制: (1)碱性前孵育液(pH10.0): 0.1M巴比妥钠2ml,0.18M氯化钙2ml,蒸馏6ml (2)酸性前孵育液:0.2M醋酸盐缓冲液(pH4.6)10ml (3)底物孵育液(pH9.4):0.1M巴比妥钠2ml,0.18M氯化钙1ml,蒸馏水7ml,三磷酸腺苷二钠盐(adenosine-5′-triphosphate,disodium)25mg,调pH至9.4。 操作方法: 1、新鲜组织低温恒冷切片厚6μm,分别贴于2张玻片上,风扇吹干。 2、取一张切片,于碱性前孵育液(pH10.0)室温孵育15分钟。 3、取另一张切片,入酸性前孵育液(pH4.6)室温孵育5分钟,然后再入碱性前孵育液(pH10.0)洗30秒钟。 4、将上述二张切睛入底物孵育液(pH9.4)于室温孵育30-45分钟。 5、1%氯化钙液浸洗3次,每次约3分钟。 6、2%氯化钴液处理3分钟。 7、于0.01M巴比妥钠液充分洗4-5次。 8、流水冲洗1分钟,蒸馏水洗。 9、1%硫化铵液处理1分钟。 10、充分水洗。 11、常规脱水透明,中性树胶封固。 |